媒介
CAR-T细胞治疗中，体内T细胞耐久性和优良的临床成果之间有必然的相关性，今天小编次要引用的研究强调了接纳需要CAR-T细胞培育物的弥补而不需要额外的基因润色对改善CAR - T细胞造造的重要性，摸索了人血衍生成品做为培育基弥补剂培育CAR-T细胞对CAR - T细胞表型的影响，发现用hPL做为一种GMP级的培育弥补剂替代传统的FBS或ABS血清，可在T细胞在TN期和TCM期必然水平上阻遏CAR - T细胞分化，为末产物细胞治疗造剂产物中获得较低分化表型的细胞同时在体表里与靶细胞长时间共培育的尝试情况下展现了优良的抗肿瘤效应博体比分。
（一）
1-1 CAR-T细胞在hPL体外培育系统中获得维持低分化T细胞表型
为了评估细胞体外扩增阶段差别人血衍生物对CAR - T细胞功用的影响，研究者起首将在添加10%胎牛血清的培育基中培育的OKT3/CD28刺激的T细胞，利用表达第二代前列腺干细胞抗原(PSCA)或CD19特异性CAR（含内构造域CD28和CD3z）的逆转录病毒载体转导此T细胞获得别离为P28z和1928z的两种T细胞博体比分。转导后3天T细胞培育被分红三种组别离是：添加10%胎牛血清、添加10% ABS以及添加10% hPL的培育基中培育扩增1周(图1a)（本尝试中每组都添加了不异量的IL-2）。
图1a：尝试设想时间线
扩增成果发现那三组培育弥补剂中T细胞扩增总体无统计学差别博体比分。然而当查抄扩增细胞的表型图谱时，hPL中培育组中的细胞显示在CD8*和CD4* T细胞部门中代表初始T（TN）和中央记忆T细胞(TCM)的CCR7*细胞比例明显更高(图1C和D)。
图1c和1d：P28z和1928z两种T细胞在FBS/ABS/hPL差别的培育系统中扩增时TN/TCM的比例
此外还摸索了与记忆(CD62L, CD127, CD27和CD28)、激活(CD25和CD69)和按捺(PD1和TIM3)相关的其他细胞外表marker的表达博体比分。hPL扩增的细胞中CD25、CD69、PD1和TIM3的表达增加，而ABS扩增的细胞中CD25、CD69、PD1和TIM3的表达降低((图S1d), 而在ABS中扩增的细胞在CD8+和CD4+ T细胞亚群中CD62L+表达较低，以及非转导T细胞(NT)、P28z和1928z中CD4* T细胞中CD27*CD28*群体数量的削减(图S1c)。
图 S1c&d P28z和1928z两种T细胞在FBS/ABS/hPL差别的培育系统中相关细胞表白marker表达
此外，研究者发现较低的hPL浓度(低至2.5%)也不会毁坏T细胞的生长或表型，不像FBS在浓度低于5%会障碍T细胞的扩增(图S2)博体比分。
图S2:差别浓度梯度的FBS/ABS/hPL的T细胞体外培育效果
研究者进一步的通过RNAseq阐发(第7天改换培育基)p28z润色细胞的特征，发现细胞在hPL培育组的细胞群中高表达TN /TCM相关基因如LEF1、FOXP1和KLF1以及较少的效应T细胞(TE)相关基因编码转录因子如TBX21、eoms和KLRG1以及效应分子如粒酶、穿孔素和IFNy博体比分。
因而，按照以上表型和基因表达谱相关研究成果，在hPL中扩增的T细胞培育物有利于具有TN/ TCM特征的细胞亚群的扩增的趋向博体比分。
1-2 TGFβ1在维持低分化CAR - T细胞表型方面的影响和感化
以上两种差别CAR模子的研究中，因为hPL培育组的T细胞始末优于ABS或FBS对应的T细胞，所以研究者试图确定详细影响T细胞表型的成分博体比分。
起首尝试人员对ABS和hPL停止了人类卵白量组学阐发，发现与ABS比拟hPL含有更高程度的转化生长因子β1 (TGFβ1)博体比分。因为之前的研究发现TGFβ1能够阻遏T细胞分化，促进活化和记忆T细胞的存活[参考文献1-3]，因而初步判断TGFβ1对维持低分化T细胞表型有必然的影响。
为了摸索TGFβ1对记忆T细胞表型的特异性影响，继续在FBS和ABS培育物中添加重组TGFβ1 (5 ng/mL)，使其程度一般化到10% hPL培育物中相当的程度博体比分。做为额外的对照，利用转基因表达显性阴性TGFβ受体II (DNRII)的T细胞来中和hPL中的TGFβ1。有趣的是通过TGFβ1的弥补，尝试者察看到FBS和ABS培育中CCR7+细胞的比例更高，而DNRII T细胞的替代消弭了hPL对CCR7表达的影响。因而借助重组TGFβ1尝试证明发现TGFβ1对T细胞有免疫按捺感化但是那种外源性弥补的TGFβ1对CAR - T细胞的细胞杀伤消融才能有倒霉影响，而hPL培育组的CAR - T细胞的表型和功用特征可能是多种可溶性卵白的成果，TGFβ1可能是此中之一。
（二） 体外持久共培育尝试中博体比分，hPL培育的CAR - T细胞显示出更高的增殖才能，招致了强大的抗肿瘤效应
上文中提到hPL培育的TN和TCM亚群在抗原刺激下比TE具有更高的增殖才能[1C和1D]博体比分。因而，尝试人员用CellTrace Violet染料(CTV)标识表记标帜每种尝试前提下的P28z或1928z T细胞，然后别离用Capan-1PSCA或NALM6细胞刺激它们。培育5天后，我们基于CTV稀释和CAR - T细胞凋亡(Annexin V和7AAD染色)评估细胞增殖。如图3a所示，hPL扩增的P28z和1928z T细胞在抗原刺激下细胞团结数量显著增加，凋亡削减(P28z - Annexin V+凋亡细胞:FBS - 52.1±7.2%，ABS - 59.4±2.9%，hPL- 26.7±3.4%，均匀±S.E. n = 5;1928z - FBS - 80.0±2.4%，ABS - 74.9±1.7%，hPL - 41.3±2.9%，均匀±尺度差，n = 5)(图3b)。
图3a&3b：FBS/ABS/hPL组CAR - T细胞增殖和抗肿瘤反响的影响：P28z或1928z T细胞用CTV染色，别离与Capan-1PSCA或NALM6共培育5天，利用CellTrace Violet (CTV)停止细胞增殖试验和检测凋亡细胞博体比分。
因为本次研究中察看到hPL扩增的CAR - T细胞的短期细胞毒性削弱但增殖才能加强，尝试人员接下来评估了由细胞增殖及其细胞毒性效应次要影响的T细胞治疗的持久体外抗肿瘤效果博体比分。因而继续停止了一个9天的体外共培育尝试，同时监测肿瘤细胞的杀伤和T细胞的扩增情况。
P28z T细胞与Capan-1PSCA共培育完毕时，hPL培育的P28z T细胞具有较强的抗肿瘤活性，各组的详细数据为：1）肿瘤细胞倍增率：FBS - 1.4±0.5,ABS - 1.9±0.8,hPL- 0.4±0.2，均匀±S.E. n = 6；T细胞倍增率：T细胞倍增率:FBS - 5.6±3.2,ABS - 5.7±1.7,hPL- 24.7±3.7，均匀±S.E. n = 6)(图3c)博体比分。
图3c&d：体外持久共培育尝试-P28z T细胞与Capan-1PSCA细胞共培育(c)或1928z T细胞与NALM6细胞共培育(d) 9天，每3天搜集细胞，用流式细胞仪计数博体比分。
同样地，hPL培育的1928z T细胞比其他血清前提下的增殖更快、更强健，第3天细胞扩增情况数据为：FBS - 1.8±0.3,ABS - 1.8±0.3,hPL - 3.4±0.3，均匀±S.E. n = 6，第9天NALM6消弭的数据为：肿瘤细胞扩增倍数:FBS - 15.5±10.0,ABS - 20.2±14.7,hPL - 0.06±0.03，均匀±S.E. n = 6)(图3d)博体比分。
总之，持久体外T细胞与肿瘤细胞共培育尝试中，因为hPL培育的CAR - T细胞更高的增殖才能其整体杀伤肿瘤效果优于在FBS或ABS中扩增的CAR - T细胞博体比分。
（三）
3-1 hPL扩增的P28z T细胞在体内抗肿瘤感化加强
为了评估在差别人血衍生物做为弥补剂的培育前提下的CAR - T细胞在体内的抗肿瘤感化，我们将Capan-1PSCA细胞移植到小鼠体内，然后在肿瘤到达100mm³(大要肿瘤植入后21天的预估尺寸)时，静脉打针GFP/ FL标识表记标帜的P28z T细胞(图4a)博体比分。有趣的是无论培育前提若何，我们察看到肿瘤部位P28z T细胞的扩增程度类似(图4b)。然而，当我们通过caliper丈量评估每只小鼠的更大抗肿瘤反响时(从T细胞治疗后的第10天到第35天)，hPL培育组的P28z T细胞治疗的动物有更好治疗成果(hPL;38 + 22 mm3, 9/12无肿瘤，FBS;81 + 19 mm3, 1/12无肿瘤，ABS;104 + 27 mm3, 2/12无肿瘤，均匀+下颌骨，n =12)(图4c)。在CAR - T细胞治疗后的第112天跟踪各组肿瘤复发情况，发现3只小鼠仍然没有肿瘤(图4d和e)，而那些复发的小鼠在稍后复发，是抗原阴性复发的成果(附加文件2:图S4)。
图5 P28z T细胞耐久性及对肿瘤再发模子的抗肿瘤感化
进一步研究在体内hPL培育组的细胞能否表示出更好的耐久性和庇护才能，尝试人员停止了一个肿瘤复发模子尝试，在该模子中对肃清原发肿瘤的小鼠[在给药高剂量T细胞(2 × 106个T细胞/只小鼠)后，在对侧腹部用移植入不异的肿瘤细胞 (图5a)博体比分。在CAR - T细胞治疗42天后，我们察看到大大都动物已经消弭了它们的原发肿瘤(FBS;5/5, ABS;5/6, hPL, 6/6)(图5b，灰色布景)。如图5b(浅绿色布景)所示: P28z (hPL) T细胞处置的小鼠肿瘤生长延迟 (2/6)或完全消弭肿瘤(2/6) ，而P28z (FBS) T细胞处置的小鼠仅1/4小鼠肿瘤生长延迟 ，而P28z (ABS)小鼠则无对照区别。我们还正式评估了T细胞在肿瘤再发模子尝试中的耐久性，并发现P28z (hPL) T细胞的生物发鲜明著更高(图5c)，表白原发肿瘤消弭后的维持的耐久性更长。那些P28z T细胞可以迁徙到新的肿瘤部位扩增并产生细胞毒性(图5d和5e)，从而延缓肿瘤生长或完全消弭肿瘤。
3-2 hPL扩增的1928z T细胞在体内表示出更高的增殖才能和消弭NALM6肿瘤才能
为了研究hPL培育的CAR- T细胞的抗肿瘤效果能否超出了Capan-1PSCA模子，研究者继续停止了第二个异种移植小鼠模子，通过GFP/FL+ NALM6细胞移植小鼠(i.v)，然后(3天后)输注1928z T细胞(5 × 106细胞/小鼠，i.v)(图6a)博体比分。成果发现利用FBS或ABS培育的细胞治疗的小鼠在随后不久复发，而利用hPL法培育的CAR - T细胞治疗的小鼠产生了较长的无瘤保存期(图6c和d)，那与T细胞治疗后第8天和第13天的优势T细胞数量有关(图6e)。因为NALM6肿瘤细胞优先定位于骨髓和次生淋巴样器官(图6b)，尝试者也通过将GFP/FL转导的1928z T细胞输注到NALM6小鼠中来逃踪T细胞的迁徙和扩增情况(图6f)。
图6 1928z T细胞在FBS/ABS/hPL中扩增后的体内表示
如图6g所示，1928z (hPL) T细胞在疾病部位快速而强健地扩增，而且比FBS或ABS中1928z T细胞扩增的时间更长(图6h)博体比分。那些发如今高T细胞剂量下得到了重现(附加文件2:图S6)。总之那些数据表白CAR - T细胞在hPL中的体外扩增中加强了CAR - T细胞的功用。
结论
与FBS或ABS比拟，hPL培育系统的CAR - T细胞表示出高增殖才能和加强的持久体内耐久性，从而产生优胜的抗肿瘤效果博体比分。那些数据证了然hPL可用于造备临床级此外CAR - T细胞产物供患者治疗利用。值得留意的是，hPL来自多个可输血供者的血小板，最后开发的目标是撑持MSCs的体外扩增，用于临床包罗GVHD、克罗恩病、肌萎缩性侧侧症和多发性硬化症等一系列本身免疫性疾病的治疗。因而那篇研究是早期第一攻讦估hPL做为培育基弥补剂对CAR - T细胞表型或功用影响的研究之一。
美国Sexton公司无动物源无需添加肝素的人血小板裂解液,既供给典范的Stemulate血替产物满足干细胞治疗用户科研和临床以及GMP消费需求，又针对免疫细胞治疗供给病原体去除（Pathogen Reduced,PR）工艺的临床级nLiven和袋拆封锁系统T-Liven血小板裂解液产物满足兼顾细胞治疗平安和性能的需求，所有产物契合量量和监管要求且已在FDA已经存案药物主文件，是全球临床干细胞和免疫治疗应用顶用做高性能FBS/ABS替代品博体比分。
nLiven PR-涉及PR病原体去除工艺的hPL-免疫细胞治疗用
T-Liven PR：涉及PR病原体去除工艺的封锁袋拆系统的hPL
更多关于Sexton血小板裂解液（血清替代）的产物信息博体比分，欢送征询上海曼博生物！
也欢送存眷博体比分我们的公家号查看更多产物手艺文章：Mine-bio
参考文献
1. Gorelik L, Flavell RA. Abrogation of TGFbeta signaling in T cells leads to spontaneous T cell differentiation and autoimmune disease. Immunity. 2000;12:171–81.
2. Zhang N, Bevan MJ. TGF-beta signaling to T cells inhibits autoimmunity during lymphopenia-driven proliferation. Nat Immunol. 2012;13:667–73.
3. Ma C, Zhang N. Transforming growth factor-beta signaling is constantly shaping memory T-cell population. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112:11013–7.
4. Torres Chavez et al博体比分，Expanding CAR T cells in human platelet lysate renders T cells with in vivo longevity.Journal for ImmunoTherapy of Cancer. (2019) 7:330
