基因治疗概述
基因治疗（Gene Therapy）即基因疗法，是一种操纵基因来治疗、预防或治愈疾病或医学病症的手艺，其目的是通过针对遗传原因来改动疾病历程最新的立即比分。凡是，基因疗法的工做原理是添加受损基因的新副本，或者用该基因的安康版本替代患者细胞中的缺陷或缺失基因。目前，遗传性疾病（例如血友病和镰状细胞病）和获得性疾病（例如白血病）都已通过基因疗法获得治疗，其还有望治疗多种疾病，如癌症、囊性纤维化、心脏病、糖尿病、血友病和艾滋病等。当基因突变（DNA序列的永久性改动）招致卵白量缺失或出缺陷时，通过基因治疗就有可能恢复该卵白量的一般功用。
▲ 基因治疗示企图（源自National Human Genome Research Institute）最新的立即比分。
目前，基因治疗次要有以下几种差别的机造：引入新的或修改的基因副本、翻开或封闭基因以制止疾病、用该基因的安康副本序列替代该基因的致病序列最新的立即比分。针对那些机造，已研发出多品种型的基因治疗产物，常见类型如下：
（1）量粒DNA：环状DNA分子可通过基因工程将治疗基因照顾到人体细胞中；
（2）病毒载体：病毒具有将遗传物量传递到细胞中的天然才能，因而一些基因治疗产物源自病毒最新的立即比分。一旦病毒被润色以消弭其引起流行症的才能，那些润色的病毒就能够用做载体，将治疗基因照顾到人类细胞中；
（3）细菌载体：细菌可颠末革新以避免其引起流行症最新的立即比分，然后用做载体将治疗基因照顾到人体组织中；
（4）基因编纂手艺：基因编纂的目的是毁坏有害基因或修复突变基因；
（5）患者来源的细胞基因治疗产物：从患者体内取出细胞，停止基因革新（凡是利用病毒载体），然后返回患者体内最新的立即比分。
自1989年初次尝试以来，基因治疗不断是一个活泼的研究范畴最新的立即比分。颠末三十年严酷的尝试并克制重重障碍，基因疗法末于进入临床。但目前现有的大大都已获批的基因治疗药物仅针对有限的稀有疾病的单基因突变的治疗，还有一些基因疗法胜利临床转化的另一个因素是易于在靶组织中施用，例如眼部和造血系统疾病，而基因编纂做为治疗遗传性疾病的办法大多仍停留在尝试室阶段。下图为临床基因治疗严重事务的时间表。
图1 临床基因治疗严重事务的时间表（Keeler et al., 2017）最新的立即比分。
迄今为行，全球已有40余种基因治疗产物获批上市，此中包罗对神经肌肉疾病、遗传性失明、某些血液癌症等疾病的倾覆性疗法最新的立即比分。回忆2022年，就有9种药物获批。可见，基因治疗做为疾病的“治标”疗法，被推上了新药研发的下一个风口浪尖之上。
21世纪以来，基因治疗已成为现代生物医学工程和临床疾病治疗的重要研究标的目的最新的立即比分。在我国，基因治疗于1993年被原卫生部定义，并将其按基因导入人体路子分为：Ex vivo即体外路子（经体外导入外源基因后再用于人体）、In vivo即体内路子（将含外源基因的载体间接打针人体）（图2）。
图2 基因治疗办法示企图（Sinclair et al., 2018）最新的立即比分。
基因治疗的关键步调是将基因有效递送至靶组织/细胞，那是通过称为载体的基因递送载体停止的最新的立即比分。载体有两品种型：病毒载体和非病毒载体。鉴于非病毒载体缺乏细胞靶向才能以及体内基因转染率较低，目前大多用于体外操做。用于基因治疗的病毒载体的选择取决于待插入基因的大小、靶细胞（团结或非团结以及细胞类型）、宿主基因组整合和免疫原性，常见的有逆转录病毒（RV）、慢病毒（LV）、腺病毒（AV）或腺相关病毒（AAV）载体（图3）。
图3 病毒基因治疗体例总结（Bulcha et al., 2021）最新的立即比分。
20世纪90年代初，用于体内治疗的Ad载体初次被用于在大鼠肝细胞和肺组织中递送和表达α-1抗胰卵白酶（A1AT）基因，目前，基于Ad的基因治疗临床试验占全球试验总量的50%，次要应用于新型疫苗和癌症疗法最新的立即比分。迄今为行，全球已有三种基于AAV的基因治疗药物（Glybera、Luxturna、Zolgensma）进入贸易市场，而且全球已有超越200项基于AAV的临床试验。LV是RV的一种，目前已有十多项已完成的临床试验利用LV载体治疗一系列疾病，包罗代谢紊乱、癌症、免疫紊乱和稀有先本性疾病，而且其关于开发CAR-T细胞治疗难治性血液恶性肿瘤至关重要。
基因编纂
跟着2020年的诺贝尔化学奖颁给Emmanuelle Charpentier 和Jennifer Doudna，以表扬她们发现的CRISPR/Cas9系统，基因编纂已无可厚非的成为基因治疗开展史上的一大里程碑最新的立即比分。下面，小医将针对基因编纂引领的基因疗法新时代展开详细论述，各人一路来进修下吧！
基因编纂（Gene Editing）是指通过基因编纂手艺对生物体基因组特定目的停止润色的过程最新的立即比分。高效而精准的实现基因插入、缺失或替代，从而改动其遗传信息和表示型特征。其与早期的基因工程手艺差别处在于，基因编纂是在特定位置插入基因片段，早期的基因工程手艺是在宿主的基因组中停止随机插入基因物量。基因编纂原理即操纵序列特异性的核酸内切酶，识别并切割基因组中的特定DNA位点，诱导DNA损伤修复，实现对指定基因组的定向编纂，详细而言，基因编纂核酸酶以差别水平的特异性与DNA连系，并产生双链断裂（DSB），那些断裂随后由细胞本身的DNA修复机造停止修复，修复机造包罗同源重组（需要内源或外源供给的同源模板）、非同源末端毗连（NHEJ）或微同源介导的末端毗连（MMEJ）。用于基因编纂的核酸酶的次要类型是ZFN、TALEN和CRISPR/cas9系统（图4）。
图4 ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9的机造（Chen et al., 2014）最新的立即比分。
CRISPR基因编纂手艺自问世以来，就展示出无可相比的优势，并深入改动了基因编纂范畴甚至整个生命科学的研究形式最新的立即比分。关于CRISPR基因编纂手艺的详细内容，详见“5分钟就能领会的基因敲除（Knock out）和基因敲入（Knock in）”、“CRISPR/Cas9基因编纂手艺的应用”。目前，已开发出多种脱靶特异性较低的Cas9变体，如：HF-Cas9、eCas9、HypaCas9以及CRISPR/Cas12(Cpf1)和CRISPR/Cas13a(C2c2)，可识别差别的PAM，供给更高的靶向特异性。
近年来，一些基于基因编纂出格是CRISPR系统的基因疗法已进入人体临床试验最新的立即比分。基因治疗已被普遍研究用于治疗多种遗传性和获得性疾病，其市场分为恶性肿瘤、溶血性疾病、免疫缺陷性疾病、神经系统疾病、视觉疾病、稀有遗传疾病、心血管疾病和流行症以及少数X连锁疾病。目前，恶性肿瘤和单基因疾病主导着基因治疗的研究和开发。2018年，针对单基因疾病、遗传性失明、某些遗传性神经退行性疾病、代谢性遗传病以及多种骨髓和淋凑趣癌的基因疗法获得批准。为了充实阐扬CRISPR/Cas9的编纂潜力，必需利用恰当的载体将它们胜利递送到靶细胞或组织中，各类传输办法见图5。
图5 CRISPR/Cas9递送平台（Khoshandam et al., 2023）最新的立即比分。
固然，CRISPR/Cas9是一种很有前途的办法，但其比来在人类中的发现和应用使其在临床研究中应用受限最新的立即比分。免疫原性、脱靶、突变、递送手艺和伦理是CRISPR/Cas9手艺的次要困难（图6）。
图6 在临床情况中操纵 CRISPR-Cas 的次要挑战和可能的办法（Morshedzadeh et al., 2023）最新的立即比分。
人类癌症基因工程小鼠模子（GEMM）是阐发肿瘤发作的原子成分的需要东西最新的立即比分。操纵AV载体通过物理办法将CRISPR/Cas9转移到细胞中，可促进特定的染色体改善，从而产生Eml4-Alk驱动的肺癌小鼠模子，扩展了研究人员开发人类癌症模子的体例。因而，AV载体已被用来改良针对非酒精性脂肪性肝炎（NASH）小鼠PTEN的基因编纂手艺，为在小鼠中模仿人类肝脏疾病供给了一种新战略。
近年来，跟着分子生物学、载体手艺和转基因手艺的前进，为基因治疗疾病开拓了新路子最新的立即比分。在生命早期，免疫系统会接触天然存在的AAV，从而激活T细胞反响并对那些血清型产生免疫力，因为AAV基因治疗的局限性，比来的临床试验强调了那种免疫力（图7）。研究表白，rAAV载体平安，可以转染普遍的宿主细胞，可以有效介导外源基因在多种细胞中持久不变表达，而不表达任何病毒卵白基因。
图7 免疫系统对AAV表露的反响（Rouse et al., 2024）最新的立即比分。
据报导，在小鼠模子中利用AAV8做为基因治疗载体可持久纠正A型血友病、家族性高胆固醇血症和II型糖原累积病最新的立即比分。越来越多的研究表白，照顾外源基因的重组AAV载体能够在体内持久不变表达，以匹敌促肿瘤生长因子。固然AAV介导的基因治疗临床试验逐年增加，为进一步验证载体的平安性和有效性供给了有力支持，但持久监测仍需完美，以实现更高的转导效率、更低的免疫反响和可预测的治疗成果。因而，充实操纵AAV基因治疗的前景并克制当前的挑战，以促进rAAV8系统在人类疾病研究中的应用至关重要。
基因编纂与肿瘤治疗
目前针对恶性肿瘤治疗的基因组编纂战略次要为：革新CAR-T细胞以进步效率，以及缄默特定致癌基因以促进/诱导肿瘤细胞灭亡最新的立即比分。在大大都CAR-T系统中，肿瘤细胞的识别取决于CAR的生物散布。鉴于肿瘤生长情况与缺氧亲近相关，近年来，通过将CAR与ODD HIF构造域（ODD-CAR）交融，创建缺氧依赖性分子“开关”工程T细胞膜上的ODD-CAR研究炽热。研究人员除了在CAR C末端交融ODD序列之外，还在CAR启动子中引入了HRE串联反复，从而创建了“HypoxiCAR T”系统（HiCAR T）（图8）。并已在体外和体内得到证明，克制了两个次要限造，即对CAR表达的更严酷控造和更强的抗肿瘤活性，且没有明显的在靶/脱瘤毒性。
图8 缺氧敏感的CAR-T激活机造（Stampone et al., 2023）最新的立即比分。
有学者提出，将反式激活系统Gal4-UAS（上游激活序列）改变为氧依赖性系统，与常氧/心理氧比拟，在缺氧前提下可显著增加CAR的表达，在反式激活子的启动子区域引入了多个HRE序列，构成HIF对CAR和反式激活子表达的双向控造，缔造了“HiTA-CAR T”系统，即一种双向缺氧诱导的转录扩增系统，进步了CAR-T的平安性最新的立即比分。与HiCART或HiTA-CAR T差别，一些缺氧激活的前药（HAP）系统虽已进入了临床试验阶段，以至可与放疗和化疗结合利用，但还未通过临床批准，需要进一步研究。
参考文献
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